La biologie moléculaire est devenue incontournable dans l’étude des processus biologiques impliqués dans le traitement des eaux résiduaires. Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour caractériser les populations microbiennes des boues activées, apportant des informations essentielles à la compréhension et à l'optimisation du fonctionnement des stations d’épuration.

Longtemps, l’étude des stations d’épuration s’est limitée au suivi des données physico-chimiques en entrée et en sortie de l’installation, considérant le bassin biologique comme « une boîte noire » où avaient lieu des réactions chimiques mal comprises, réalisées par des micro-organismes non identifiés. La microbiologie des boues activées a permis de lever de nombreuses zones d’ombre sur la nature des réactions existant dans le bassin biologique et le rôle des micro-organismes présents. Avec l’arrivée de la biologie moléculaire, de nouvelles informations capitales ont été apportées, notamment sur la relation identité/fonction des micro-organismes, améliorant encore notre connaissance des mécanismes de dépollution mis en jeu au sein des stations d’épuration.

Pour caractériser l’aptitude des boues activées à traiter un type de polluant, le microbiologiste doit répondre à plusieurs questions dont les principales sont : qui, combien, comment ? Les méthodes de microbiologie traditionnelles, dites pasteuriennes, ne répondent que très imparfaitement à ces questions. L’identification et le dénombrement des micro-organismes se font par microscopie sur des critères morphologiques ou de coloration, ou encore par tests biochimiques après isolement et culture sur boîtes de Petri ou en milieux liquides. Or, la très grande majorité des micro-organismes est incultivable sur ces milieux car les facteurs nécessaires à leur croissance restent inconnus. De plus, ces méthodes requièrent l’isolement du micro-organisme de son milieu naturel et de sa communauté, ce qui biaise forcément l’évaluation de ses activités.

Les méthodes moléculaires, en s’affranchissant de la mise en culture, réduisent énormément les biais des méthodes pasteuriennes. Elles permettent de caractériser les micro-organismes d’un échantillon, qu’ils soient cultivables ou non, dans leur environnement naturel (Huybens et al., 2009). Ces techniques utilisent des séquences (1) d’ADN (2)  spécifiques des micro-organismes cibles afin de les identifier et de les dénombrer. Selon que la séquence ciblée est choisie dans une région très conservée (3) des gènes marqueurs, ou au contraire dans une région très variable, il sera mis en évidence des groupes microbiens très divers, ou bien des micro-organismes très ciblés (espèce ou sous-espèce bactérienne). D’un point de vue pratique, seule une centaine de millilitres de boue activée est nécessaire à la réalisation de dizaines, voire de centaines d’analyses moléculaires. Ces techniques sont donc particulièrement puissantes dès lors que la représentativité de l’échantillonnage est bien assurée.

Cet article présente les outils couramment utilisés aujourd’hui pour caractériser les populations microbiennes des boues activées (identification, biodiversité, quantification) en détaillant leurs principes et en donnant quelques exemples d’application en épuration des eaux résiduaires (tableau 1).

Détection et identification des micro-organismes en microscopie

En microscopie classique, il est possible d’étudier la structure des flocs (4) (taille, morphologie), mais il est très difficile d’identifier les différents micro-organismes présents. Des colorations (Gram, Neisser) permettent d’identifier quelques grands groupes de bactéries, mais déstructurent complètement l’organisation du floc.

La technique FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), qui combine biologie moléculaire et microscopie, présente l’avantage considérable de pouvoir à la fois identifier de manière fiable les micro-organismes présents et visualiser leur morphologie ainsi que leur répartition spatiale au sein des flocs. La puissance de cette technique réside dans sa simplicité et sa rapidité de réalisation (quelques heures). Son principe repose sur l'utilisation de sondes (5) fluorescentes complémentaires de séquences spécifiques de l'ARN des ribosomes (6) (ARNr (7)) des cellules ciblées. Après traitement chimique de la membrane des cellules, les sondes vont pouvoir y entrer et se fixer sur leurs cibles. La fluorescence émise est alors observable avec un microscope dit « à épifluorescence » (figure 1). Il est possible d’utiliser plusieurs sondes simultanément sur un même échantillon, marquées avec des fluorophores différents (multiplexage). Pour identifier un micro-organisme, il est toutefois nécessaire qu’une sonde spécifique existe, ce qui n’est pas toujours le cas, même si plus de 2500 sondes ont été développées à ce jour (http://www.microbial-ecology.net/probebase/).

Grâce à cette technique, il a été mis en évidence que les AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria) et les NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria), bactéries réalisant respectivement la première et la deuxième étape de la nitrification, étaient spatialement proches dans le floc, rendant les produits de la première réaction rapidement utilisables comme substrats pour la seconde (Mobarry et al., 1996).

En routine, le FISH se révèle très utile pour identifier rapidement et simplement les bactéries filamenteuses, qui peuvent être responsables de dysfonctionnements biologiques en stations d’épuration (foisonnement des boues et/ou moussage). En effet, les techniques classiques de coloration ne permettent pas toujours de le faire avec certitude (variabilité des colorations, expérience de l’observateur). Il est alors possible de mettre en place sur site des solutions préventives ou curatives adaptées à la bactérie incriminée.

 

Étude de la biodiversité microbienne

La technique FISH ne permettant de visualiser simultanément qu’un nombre limité d’espèces différentes sur un même échantillon, les études de diversité microbienne font généralement appel à d’autres techniques appelées « techniques de typage moléculaire ». Dans cette approche, les cellules sont lysées, leur ADN est purifié et les gènes d’intérêt sont amplifiés par PCR . Le plus souvent, les gènes ciblés codent pour des ARNr microbiens et permettent une identification phylogénétique (8) des espèces. Il peut aussi s’agir de gènes dits « de fonction », codant pour des enzymes importantes pour les réactions biochimiques de dépollution comme celles intervenant dans la nitrification ou la dénitrification. Les produits de PCR obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse (9) dans une matrice de polymères.

Une de ces techniques, la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), est un procédé d’électrophorèse sur gradient de dénaturants chimiques qui permet d’observer les différences de mobilité de fragments d’ADN de même taille, mais de séquence différente. Sous l’effet d’un champ électrique, les produits de PCR migrent dans le gel et rencontrent des concentrations en dénaturants de plus en plus importantes, entraînant la dénaturation progressive de leurs brins d’ADN selon leur composition en bases GC et AT . L’abondance des bandes sur le profil électrophorétique obtenu reflète la biodiversité de la communauté pour les micro-organismes considérés, chaque bande correspondant au moins à une espèce cible (figure 2). En découpant les bandes sur le gel et en réamplifiant par PCR l’ADN qu’elles contiennent, il est également possible de connaître l’identité du micro-organisme correspondant après séquençage. (cf tableau 1 et partie ­­« séquençage »). La DGGE reste lourde à mettre en œuvre car elle nécessite au moins deux jours de manipulations, depuis l’extraction d’ADN jusqu’à la révélation des fragments d’ADN du gel sous illumination UV. De plus, l’identification des espèces est longue car elle fait appel aux techniques de séquençage décrites ci-dessous. En revanche, elle présente l’avantage de pouvoir visualiser jusqu’à une trentaine d’espèces en une seule fois et peut être mise en œuvre sur plusieurs dizaines d’échantillons en parallèle.

La biodiversité des bactéries nitrifiantes, qui assurent la transformation de l’ammoniaque en nitrates au sein du bassin biologique, est très étudiée. Cette technique a permis de montrer que des espèces nitrifiantes différentes se développaient dans les stations d'épuration des eaux usées urbaines et industrielles, en fonction principalement de la concentration en ammonium de l'influent (Kreuzinger et al., 2003).

En routine, la DGGE peut être utilisée, par exemple, pour évaluer l’impact de conditions de fonctionnement particulières d’une station d’épuration sur une communauté microbienne donnée. Les bactéries nitrosantes (AOB) étant très sensibles aux conditions environnementales (température, variation de charge, toxique), la nitrification peut être facilement impactée et les niveaux de rejet en sortie de station non respectés.

Inventaire des micro-organismes présents dans les boues

Le séquençage permet, à partir d’une séquence cible d’ADN, de retrouver l’identité du micro-organisme correspondant après comparaison avec une base de données. Il est utilisé pour réaliser l’inventaire des espèces ou des fonctions potentielles d’un écosystème comme les boues activées par exemple.

Le séquençage selon la méthode originale de Sanger a été mis au point dans les années 1970. Ce fut une révolution dans le domaine de l’identification des micro-organismes. Cependant, la limitation de cette technique tenait principalement à sa faible capacité de lecture et à sa lenteur : il aurait fallu en effet plusieurs dizaines d’années à un séquenceur fonctionnant jour et nuit pour décrypter les millions de bases d’un génome bactérien. Aussi, le nombre de séquences analysables n’était que de quelques centaines et les inventaires réalisés sur des boues activées ne permettaient d’observer que les espèces présentes à plus de 108 cellules par millilitre, c'est-à-dire représentant quantitativement moins de 1% de la communauté. Avec cette approche, les bactéries nitrifiantes, présentes souvent à des concentrations de 106 à 108 cellules par millilitre de boues activées, n’étaient pas détectées.

Depuis 2005, avec le séquençage haut-débit dit « de nouvelle génération »,  la même opération est dorénavant réalisée en quelques heures seulement et le nombre de séquences obtenues s’élève à plusieurs millions. Toutefois, le traitement du grand nombre de données générées est lourd, il nécessite des connaissances approfondies en bioinformatique et plusieurs jours d’analyse.

Cette technique a permis de grandes avancées dans la connaissance phylogénétique des bactéries filamenteuses. On s’est en effet rendu compte que des bactéries très proches morphologiquement étaient en fait très éloignées phylogénétiquement et avaient des fonctions et activités différentes (Wagner et Cloete, 2002).

L’apport de cette technique est capital : il est désormais possible d’inventorier les différents micro-organismes présents dans un échantillon de boues activées sur une seule plaque de séquençage (de moins d’1 cm2), ou d’avoir accès à leur activité métabolique à un instant donné.

Quantification des micro-organismes

Pour améliorer la compréhension des procédés, les données obtenues à l’aide des outils moléculaires doivent être quantitatives. L’outil le plus utilisé aujourd’hui est la PCR en temps réel (qPCR), technique précise, rapide, et facilement automatisable. Le principe est le même que celui d’une PCR classique,  à la différence que l’amplification du fragment d’ADN est mesurée en continu à l’aide d’agents intercalants (11) de l’ADN double brin ou de sondes fluorescentes. Cette méthode nécessite la réalisation d’une gamme étalon à l’aide de solutions d’ADN cible de concentrations connues. Le nombre de copies d’ADN cible étant doublé à chaque cycle, la fluorescence augmente de la même façon. Le logiciel détermine alors pour chaque échantillon un « seuil de quantification » (Cq), correspondant au nombre de cycles pour lequel la fluorescence devient significativement différente du bruit de fond. Comparée à celles de la gamme étalon, la valeur de Cq permet d’estimer la quantité d’ADN cible de l’échantillon correspondant (figure 4). Le nombre de micro-organismes d’intérêt peut ensuite être déduit en connaissant le nombre moyen de copies du gène ciblé par cellule (www.mmg.msu.edu).

Cette technique a permis de quantifier dans les boues activées des micro-organismes appelés AOA (Ammonium Oxidizing Archaea), archées capables de réaliser la première étape de la nitrification (Park et al., 2006). Développée à l’origine pour quantifier les séquences d’ADN et dénombrer ainsi les micro-organismes, cette technique est actuellement adaptée à la quantification des ARN afin de quantifier l’expression de gènes d’intérêt et approcher l’activité des micro-organismes.

En routine, la qPCR peut être utilisée, par exemple, pour suivre l’impact d’un traitement curatif (chloration, sels métalliques) sur la quantité de bactéries filamenteuses présentes dans les boues activées, et de pouvoir ainsi conclure sur son efficacité ou bien adapter le dosage sur site.

 

Conclusion

La liste de méthodes présentée ici est loin d’être exhaustive. De nombreuses autres techniques moléculaires sont utiles à l’analyse microbiologique des boues activées. Les progrès sont très rapides et ces techniques en constante évolution, devenant au fil des années plus rapides, plus efficaces et moins coûteuses. De plus, la plupart des techniques utilisées aujourd’hui peuvent être automatisées pour traiter rapidement un grand nombre d’échantillons. Cependant, la microbiologie des boues activées reste un domaine où de grandes inconnues subsistent, à cause de la complexité de ce milieu, tant au niveau des processus biologiques que des micro-organismes impliqués. Aujourd’hui, le couplage systématique des méthodes de microbiologie moléculaire à celles du génie des procédés permet toutefois de mieux comprendre et optimiser les procédés de traitement des eaux résiduaires.

Pour citer cet article :

Référence électronique :
JUZAN, Lauriane ; PERNELLE, Jean-Jacques ; DABERT, Patrick, Les outils de la biologie moléculaire pour l’analyse microbiologique des boues activées , Revue Science Eaux & Territoires, Recherche et Ingénierie au service des acteurs de l’assainissement, numéro 09, 2012, p. 76-81, 19/12/2012. Disponible en ligne sur <URL : http://www.set-revue.fr/les-outils-de-la-biologie-moleculaire-pour-lanalyse-microbiologique-des-boues-activees> (consulté le 16/11/2018), DOI : 10.14758/SET-REVUE.2012.9.12.

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